Miles Morales là một thiếu niên New York đang phải đấu tranh với những kỳ vọng đặt ra bởi bố cậu—cảnh sát Jefferson Davis, vốn là một người luôn coi Spider-Man là hiểm họa. Sau khi chuyển tới học tại trường nội trú, Miles tới thăm người chú Aaron Davis và được chú dẫn tới một ga tàu điện ngầm bỏ hoang để cậu có thể thoải mái thể hiện đam mê vẽ graffiti của mình. Tại đây, Miles bị một con nhện nhiễm phóng xạ cắn, và từ đó cậu bắt đầu sở hữu những khả năng giống như loài nhện. Quay trở lại nhà ga bỏ hoang, Miles phát hiện ra cỗ máy siêu gia tốc hạt chế tạo bởi Kingpin, kẻ đang mong muốn mở ra các vũ trụ song song để mang người vợ và người con đã khuất trở về. Hắn cho rằng nguyên nhân cái chết của họ/cả hai là do Spider-Man gây ra. Miles đã chứng kiến Spider-Man nỗ lực vô hiệu hóa chiếc máy gia tốc khi chiến đấu với Green Goblin và Prowler. Spider-Man giải cứu Miles, nhưng Green Goblin đã đẩy Spider-Man vào máy gia tốc, tạo nên vụ nổ giết chết Green Goblin và khiến Spider-Man bị thương nặng. Anh đưa cho Miles một ổ USB flash để vô hiệu hóa máy gia tốc, đồng thời cảnh báo rằng cỗ máy có thể sẽ phá hủy toàn bộ thành phố nếu như nó bị kích hoạt trở lại. Sau khi chứng kiến cảnh Spider-Man bị Kingpin sát hạt, Miles sợ hãi bỏ chạy và bị Prowler truy đuổi. Trong khi cả thành phố đều đang tiếc thương cái chết của Spider-Man, Miles đã cố gắng luyện tập để giữ lời hứa của mình với người anh hùng đã khuất, đồng thời cũng để trở thành siêu anh hùng mới của thành phố. Trong lúc thử sức với những khả năng mới được phát hiện, cậu đã làm hỏng ổ USB. Tại ngôi mộ của Spider-Man, Miles gặp Peter B. Parker, phiên bản lớn tuổi và bê tha hơn của Spider-Man đến từ một chiều không gian khác. Sau khi gặp anh, Miles phát hiện ra khả năng sinh điện sinh học từ cơ thể của mình. Peter miễn cưỡng đồng ý huấn luyện Miles, đổi lại, Miles sẽ giúp đỡ Peter ăn cắp dữ liệu để phục hồi ổ USB. Sau khi cả hai xâm nhập vào phòng nghiên cứu của Kingpin, Miles chợt phát hiện ra cậu có khả năng tàng hình. Họ đối đầu với Tiến sĩ Olivia Octavius, mụ ta xác nhận rằng Peter sẽ chết nếu anh ở lại chiều không gian này quá lâu do sự phân rã của các tế bào theo thời gian. Bị Octavius truy đuổi khắp khu thí nghiệm và khu rừng bao quanh, Miles và Peter sau đó được Gwen Stacy, một Spider-Woman đến từ chiều không gian khác, tới giải cứu. Họ tìm ra dì May Parker của Spider-Man đã khuất; bà tiết lộ rằng trong nhà bà đang có thêm nhiều Spider-Man đến từ các chiều không gian khác—bao gồm Spider-Man Noir, Peni Parker và Spider-Ham—và họ đều đang trong tình trạng xấu vì đã ở trong chiều không gian này quá lâu. Miles đề nghị hợp tác vô hiệu hóa máy gia tốc để các Spider-Man có thể trở về nhà, nhưng mọi người đều cho rằng cậu chưa có đủ khả năng làm chủ các kỹ năng của mình. Quẫn trí, Miles bèn tới nhà chú Aaron và phát hiện ra chú mình chính là Prowler. Miles trở về nhà của dì May mà không hề biết mình đã bị Kingpin, Prowler, Octavius, Scorpion và Tombstone bám đuôi. Trong cuộc ẩu đả, Miles bị Prowler tóm được và trong lúc Prowler gần giết chết cậu, cậu đã tự cởi bỏ lớp mặt nạ Spider-Man ra. Vì không thể giết cháu ruột của mình, Aaron đã bị Kingpin bắn trọng thương. Miles đưa Aaron chạy trốn; trước khi chết, Aaron đã nói lời ủng hộ cháu mình bước tiếp con đường mà cậu đã lựa chọn. Jefferson tới hiện trường và nhìn thấy Miles bỏ trốn, điều này khiến ông nghĩ rằng chính Spider-Man đã giết em trai mình. Cả đội siêu anh hùng tụ họp tại phòng trọ của Miles. Peter trói Miles lại để đảm bảo an toàn cho cậu, đồng thời cùng những anh hùng khác rời đi. Peter đã lựa chọn hi sinh bản thân bằng cách ở lại vũ trụ này để vô hiệu hóa máy gia tốc. Cùng lúc đó, Jefferson tới bên ngoài cửa phòng Miles, dù nghĩ rằng Miles không muốn nói chuyện với mình nhưng ông vẫn giãi bày lời xin lỗi tới con trai. Miles sau đó đã làm chủ được sức mạnh của mình và tới nhà dì May để lấy chiếc máy bắn tơ, đồng thời sơn lại một trong những bộ đồ của Spider-Man đã khuất. Cậu tham gia cùng nhóm siêu anh hùng, đánh bại lực lượng của Kingpin và dùng chiếc USB đã được Peni sửa để mở ra cánh cổng kết nối đa vũ trụ, đưa các Spider-Man khác về nhà. Kingpin sau đó chiến đấu với Miles; Jefferson đã đứng ngoài chứng kiến trận chiến. Nhận ra Spider-Man không phải là kẻ thù thực sự, ông đã động viên cậu từ phía xa. Miles làm tê liệt Kingpin và ném hắn vào bảng điều khiển của cỗ máy gia tốc, khiến cỗ máy bị phá hủy hoàn toàn. Kingpin cùng lực lượng của hắn bị bắt giữ. Jefferson cũng thừa nhận Spider-Man chính là vị cứu tinh sau khi thu thập các chứng cứ cho thấy chính Kingpin đã giết Aaron. Miles vui vẻ với trách nhiệm của mình trong vai trò mới; cùng lúc đó, những Spider-Man khác cũng trở về với cuộc sống thường nhật ở chiều không gian của riêng họ. Gwen sau đó tìm được cách để liên lạc xuyên các chiều không gian tới Miles. Ở một chiều không gian khác, Miguel O'Hara đi tới Thành phố New York năm 1967 và cãi nhau với Spider-Man ở vũ trụ ấy.
Bình luận phim Người Nhện: Vũ Trụ Mới